賽默飛分光光度計NanoDrop Eight蛋白檢測

一、前言

蛋白質定量是分子生物學、醫(yī)學、藥學和生物工程領域實驗的基礎環(huán)節(jié)。無論是進行電泳、免疫印跡，還是進行酶學分析與質譜檢測，準確測定蛋白濃度與純度都是關鍵步驟。賽默飛NanoDrop Eight分光光度計憑借高通量檢測能力、極低樣品用量及寬廣的光譜范圍，成為實驗室蛋白檢測的常用工具。

本篇將系統(tǒng)介紹NanoDrop Eight在蛋白檢測中的應用，從基本原理到操作方法，再到數據解讀與實驗經驗，全面呈現其優(yōu)勢與實踐要點。

二、蛋白檢測的原理

1. 紫外吸收法

蛋白質中含有芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸），其在280 nm處有明顯吸收峰。通過測定280 nm處的吸光度即可估算蛋白濃度。該方法簡便快捷，但要求樣品較為純凈，且需預先知道摩爾消光系數。

2. 肽鍵吸收法

在190~230 nm區(qū)間，蛋白質肽鍵會產生強吸收峰。NanoDrop Eight的光譜范圍覆蓋190 nm，因此可以通過檢測低波長區(qū)域吸收來輔助評估蛋白濃度。

3. 染料結合法

當樣品復雜、含有雜質或緩沖液對280 nm檢測有干擾時，常采用染料法。不同方法的檢測波長如下：

• Bradford法：595 nm

• BCA法：562 nm

• Lowry法：750 nm
  NanoDrop Eight能夠在全光譜范圍內檢測，因此適用于上述各種方法。

三、實驗前準備

1. 儀器準備

• 將NanoDrop Eight置于穩(wěn)定的實驗臺，避免震動干擾。

• 開機預熱3~5分鐘，確保光源穩(wěn)定。

• 檢查檢測平臺，確認無殘留或污染。

2. 樣品準備

• 緩沖液選擇：盡量使用對紫外吸收影響小的緩沖體系，如PBS或Tris。避免高濃度去污劑和有機溶劑。

• 樣品濃度：保證濃度在儀器的檢測范圍內，過高需稀釋，過低可能信噪比不足。

• 混勻處理：確保溶液均一，避免沉淀或氣泡。

3. 空白對照

• 使用與樣品相同的緩沖液作為空白，進行基線校正。

• 不同檢測方法需選用相應的空白溶液。

四、蛋白檢測的操作步驟

1. 上樣

• 使用移液器準確取1.5~2 μL樣品，滴加在檢測平臺中央。

• 避免產生氣泡，確保液滴均勻覆蓋光路。

• 關閉樣品臂，立即開始測定。

2. 模式選擇

• Protein A280模式：快速檢測純蛋白濃度。

• Protein A205模式：基于肽鍵吸收的檢測方法。

• Protein BCA/Bradford模式：適用于復雜樣品和需要染料的檢測。

• 全光譜掃描：用于評估蛋白樣品的整體吸收特征。

3. 測定流程

• 先測空白對照，建立基線。

• 依次測定各樣品，系統(tǒng)可同時檢測8個通道，提高效率。

• 每次檢測后，儀器會自動輸出濃度、純度及光譜曲線。

五、數據解讀

1. A280直接法結果

• 測得吸光度值后，結合摩爾消光系數計算蛋白濃度。

• 該方法適合高純度蛋白樣品，如純化后的重組蛋白。

2. A205法結果

• 因肽鍵普遍存在，該方法對所有蛋白普適，但背景干擾較大。

• 適用于無法使用A280的樣品。

3. 染料法結果

• 儀器會根據標準曲線自動換算樣品濃度。

• Bradford法靈敏度較高，適合低濃度蛋白檢測。

• BCA法抗干擾性強，更適合含有去污劑或鹽的樣品。

4. 光譜曲線

• 280 nm處有明顯峰值，說明蛋白濃度較高。

• 230 nm峰值過高可能提示有機物或緩沖鹽污染。

• 若在260 nm有峰值，需考慮是否存在核酸污染。

六、常見問題與解決方法

1. 吸光度過高

• 原因：蛋白濃度過高，超出檢測范圍。

• 解決：對樣品進行適當稀釋。

2. 吸收比值異常

• 問題：蛋白樣品在260 nm處吸收強烈，A260/A280比值過高。

• 原因：核酸污染。

• 解決：對樣品進行核酸去除處理。

3. 光譜曲線異常

• 問題：出現鋸齒或噪音過大。

• 原因：樣品體積不足、氣泡或平臺未清潔。

• 解決：重新加樣并清潔平臺。

4. 重復性差

• 問題：同一樣品多次測定結果差異大。

• 原因：移液操作不規(guī)范或平臺殘留。

• 解決：保持一致的上樣操作，每次檢測后及時清潔。

七、實驗經驗總結

1. 樣品處理經驗

• 蛋白濃度過低時，建議使用Bradford或BCA方法。

• 高鹽或含有還原劑的緩沖液對紫外檢測干擾明顯，應提前稀釋或更換緩沖液。

2. 數據解讀經驗

• 僅依賴280 nm單點結果可能導致誤差，建議結合全光譜掃描曲線判斷樣品質量。

• 對科研論文或報告，應保存完整光譜數據，而不僅僅是濃度值。

3. 操作規(guī)范經驗

• 樣品體積需嚴格一致，避免因液滴大小差異導致誤差。

• 建議在實驗室建立統(tǒng)一的SOP流程，尤其是對多用戶實驗室。

4. 高通量檢測經驗

• NanoDrop Eight的8通道設計非常適合批量蛋白檢測，可大幅縮短實驗時間。

• 配合自動化移液器使用時效率更高。

八、維護與保養(yǎng)

1. 平臺清潔

• 每次檢測后用無核酸酶水或70%乙醇擦拭平臺。

• 避免殘留樣品干固在檢測窗口。

2. 光源檢查

• 長時間使用后若發(fā)現光譜偏移或數據不穩(wěn)定，應聯系廠家維護。

3. 軟件管理

• 定期更新檢測軟件，保證數據處理功能穩(wěn)定。

• 實驗室應建立數據歸檔制度，統(tǒng)一保存結果。

九、應用案例

1. 蛋白純化后的濃度測定

利用A280法快速檢測目標蛋白濃度，結合純度分析判斷樣品是否可用于下游實驗。

2. 免疫學實驗準備

在進行ELISA、WB實驗前，使用Bradford法定量蛋白，確保上樣量一致。

3. 酶學實驗

使用BCA法測定酶蛋白濃度，再配合動力學實驗評估酶活性。

4. 藥物研發(fā)

檢測重組蛋白或抗體樣品的濃度和純度，保證藥效評價實驗的準確性。

十、總結

NanoDrop Eight分光光度計為蛋白檢測提供了快速、準確、靈敏的解決方案。其優(yōu)勢不僅在于所需樣品體積極少，還在于能同時完成多通道檢測，大幅提升實驗效率。在具體應用中，應根據樣品性質選擇合適的檢測模式，合理解讀光譜數據，并保持良好的實驗習慣。通過積累經驗和優(yōu)化流程，研究人員可以更好地發(fā)揮NanoDrop Eight的性能，獲得高質量的實驗數據。