賽默飛分光光度計(jì)NanoDrop Eight質(zhì)量控制詳解

一、設(shè)備原理與應(yīng)用價(jià)值

賽默飛NanoDrop Eight是一款高通量微量分光光度計(jì)，能夠在190~850 nm波長范圍內(nèi)快速測定核酸、蛋白及其他生物樣品的濃度與純度。其核心優(yōu)勢是：

1. 微量上樣：僅需1~2 μL樣品即可完成檢測；

2. 多通道檢測：可同時(shí)分析8個(gè)樣品，極大提高效率；

3. 自動光程調(diào)節(jié)：通過0.2 mm與1.0 mm光程切換，覆蓋更寬濃度范圍；

4. 直讀結(jié)果：自動計(jì)算濃度并提供純度比值。

在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，NanoDrop Eight廣泛用于DNA提取、RNA定量、蛋白純化質(zhì)量判定以及下游實(shí)驗(yàn)（PCR、測序、轉(zhuǎn)染等）的樣品質(zhì)量把控。因此，建立一套完善的質(zhì)量控制體系，是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠的關(guān)鍵。

二、質(zhì)量控制的重要性

質(zhì)量控制（Quality Control, QC）在NanoDrop Eight檢測中起到以下作用：

• 保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性：減少因操作誤差、樣品污染或設(shè)備波動導(dǎo)致的偏差；

• 提升實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性：相同樣品在不同批次檢測中應(yīng)得到一致結(jié)果；

• 確保下游實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行：高質(zhì)量的核酸或蛋白樣品是分子克隆、轉(zhuǎn)錄組測序和蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的前提；

• 符合實(shí)驗(yàn)室規(guī)范：科研與檢測機(jī)構(gòu)需符合GLP、ISO等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，NanoDrop檢測數(shù)據(jù)往往作為樣品質(zhì)量憑證。

三、樣品制備與上樣規(guī)范

1. 樣品制備質(zhì)量控制

• 核酸：提取后應(yīng)避免蛋白和鹽類殘留，可通過柱式純化或酚氯仿抽提進(jìn)一步去除雜質(zhì)。

• RNA：需在無RNA酶環(huán)境中操作，保持樣品完整性。

• 蛋白：樣品緩沖液應(yīng)透明無渾濁，避免含有過量去垢劑或高鹽。

2. 上樣操作規(guī)范

• 每次上樣量：1.5~2.0 μL，確保完全覆蓋檢測窗口。

• 避免氣泡：氣泡會導(dǎo)致光路異常，造成結(jié)果偏差。

• 樣品混勻：濃度不均勻會導(dǎo)致不同孔位結(jié)果差異大。

• 檢測后清潔：用無絨紙巾輕輕擦拭，避免殘留造成交叉污染。

3. 空白對照

• 使用與樣品相同緩沖液作為Blank，扣除背景信號。

• 每一批樣品檢測前均需進(jìn)行一次空白校正。

四、檢測流程中的質(zhì)量把控

1. 光源與光程檢查

NanoDrop Eight采用氘燈與鎢燈組合光源，190~850 nm全覆蓋。

• 定期校驗(yàn)光源強(qiáng)度，避免因燈絲衰減導(dǎo)致基線漂移。

• 確認(rèn)自動光程切換功能正常，防止?jié)舛冗^高時(shí)出現(xiàn)信號飽和。

2. 樣品檢測流程

1. 選擇檢測模式（核酸、蛋白、多肽、熒光等）；

2. 進(jìn)行空白校正；

3. 依次加載樣品，獲取吸光度曲線與濃度數(shù)值；

4. 系統(tǒng)自動給出純度比值和質(zhì)量評價(jià)。

3. 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估指標(biāo)

• 核酸：

• A260/A280 = 1.8~2.0 → 高純度DNA或RNA

• A260/A230 > 2.0 → 雜質(zhì)少，適合下游實(shí)驗(yàn)

• 蛋白：

• A280吸收峰清晰，無額外干擾峰

• 濃度在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)

五、數(shù)據(jù)可靠性與純度判定

1. 濃度結(jié)果的可靠性

NanoDrop Eight通過光程自動調(diào)節(jié)，保證了高濃度與低濃度樣品的準(zhǔn)確檢測。但仍需遵循：

• 樣品濃度應(yīng)在0.1~1.5 A的線性范圍；

• 結(jié)果最好取三次測量平均值，減少偶然誤差。

2. 純度比值的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 核酸：

• A260/A280 < 1.8：蛋白或酚污染

• A260/A230 < 2.0：鹽、碳水化合物或緩沖液殘留

• 蛋白：

• 280 nm有明顯吸收峰，若在230 nm有額外峰值，可能為緩沖液干擾。

3. 光譜曲線分析

不僅要看數(shù)值，還需查看光譜：

• DNA/RNA應(yīng)在260 nm有明顯吸收峰；

• 蛋白應(yīng)在280 nm有峰；

• 若出現(xiàn)異常雙峰或雜散峰，應(yīng)懷疑有污染。

六、常見問題與排查

1. 檢測結(jié)果波動大

• 原因：上樣不均、氣泡、窗口未清潔

• 解決：確保移液準(zhǔn)確、及時(shí)擦拭檢測窗口

2. 濃度偏低

• 原因：樣品降解或濃度超出檢測下限

• 解決：檢查樣品完整性，必要時(shí)濃縮處理

3. A260/A280過低

• 原因：蛋白污染

• 解決：柱式純化去除蛋白殘留

4. A260/A230過低

• 原因：鹽或有機(jī)溶劑殘留

• 解決：乙醇沉淀或二次洗滌

5. 通道間差異明顯

• 原因：窗口殘留物或交叉污染

• 解決：每次測量后徹底清潔

七、實(shí)驗(yàn)室管理與質(zhì)量保障

1. 建立SOP

• 明確NanoDrop Eight檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作流程

• 包含：開機(jī)校準(zhǔn)、樣品制備、上樣規(guī)范、數(shù)據(jù)記錄、清潔維護(hù)

2. 定期校準(zhǔn)與驗(yàn)證

• 使用標(biāo)準(zhǔn)DNA或BSA溶液進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證

• 每月進(jìn)行一次光源校準(zhǔn)，保證結(jié)果穩(wěn)定

3. 數(shù)據(jù)管理

• 所有檢測結(jié)果需保存至LIMS或數(shù)據(jù)庫

• 保證數(shù)據(jù)可追溯，符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理要求

4. 人員培訓(xùn)

• 新進(jìn)實(shí)驗(yàn)人員需經(jīng)過NanoDrop操作培訓(xùn)與考核

• 定期復(fù)訓(xùn)，減少人為操作偏差

八、總結(jié)

NanoDrop Eight作為高通量微量分光光度計(jì)，在核酸、蛋白及多種生物樣品的質(zhì)量檢測中發(fā)揮著重要作用。其結(jié)果不僅用于濃度測定，更是下游實(shí)驗(yàn)成功與否的重要前提。

要實(shí)現(xiàn)可靠的檢測，必須在以下環(huán)節(jié)實(shí)施質(zhì)量控制：

1. 樣品制備與上樣的規(guī)范化；

2. 空白校正與光源穩(wěn)定性的監(jiān)測；

3. 數(shù)據(jù)解讀中的純度比值與光譜曲線分析；

4. 實(shí)驗(yàn)室SOP、校準(zhǔn)、數(shù)據(jù)管理與人員培訓(xùn)的制度化建設(shè)。

通過全流程質(zhì)量控制，NanoDrop Eight不僅能提供快速高效的檢測結(jié)果，更能保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性與可靠性，為科研和臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。