賽默飛分光光度計(jì)NanoDrop Eight樣品濃度測(cè)定詳解

一、NanoDrop Eight概述

賽默飛NanoDrop Eight是NanoDrop系列的多通道微量分光光度計(jì)，專(zhuān)門(mén)用于核酸、蛋白及其他生物樣品的定量分析。與傳統(tǒng)比色皿方式不同，NanoDrop Eight采用微量上樣平臺(tái)設(shè)計(jì)，樣品體積僅需1~2 μL即可完成濃度測(cè)定。其優(yōu)勢(shì)在于：

1. 高靈敏度與高重復(fù)性；

2. 多通道設(shè)計(jì)，一次可同時(shí)檢測(cè)多達(dá)8個(gè)樣品；

3. 無(wú)需比色皿和耗材，降低實(shí)驗(yàn)成本；

4. 內(nèi)置軟件能自動(dòng)計(jì)算濃度并提供純度比值。

NanoDrop Eight覆蓋190~850 nm波長(zhǎng)范圍，能夠完成核酸、蛋白、多肽、寡核苷酸以及色素等樣品的快速定量，適合高通量分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室使用。

二、樣品濃度測(cè)量的基本原理

NanoDrop Eight的核心原理仍然基于比爾-朗伯定律：

$$A=\epsilon ?c?l$$

其中：

• $A$ 為吸光度（Absorbance）；

• $\epsilon$ 為摩爾消光系數(shù)；

• $c$ 為樣品濃度；

• $l$ 為光程。

NanoDrop Eight的特殊之處在于其采用自動(dòng)調(diào)節(jié)光程技術(shù)。常見(jiàn)光程為1 mm和0.2 mm，儀器會(huì)根據(jù)樣品濃度自動(dòng)切換，以保證結(jié)果落在檢測(cè)線(xiàn)性范圍內(nèi)。相比傳統(tǒng)1 cm光程的比色皿，NanoDrop的短光程設(shè)計(jì)大大拓寬了樣品濃度檢測(cè)范圍，可覆蓋0.2~2500 ng/μL的DNA濃度。

三、樣品濃度測(cè)量流程

1. 儀器啟動(dòng)與初始化

• 打開(kāi)NanoDrop Eight電源并啟動(dòng)軟件。

• 選擇檢測(cè)類(lèi)型（如核酸、蛋白、熒光標(biāo)記分子等）。

• 進(jìn)行光源預(yù)熱，確保檢測(cè)基線(xiàn)穩(wěn)定。

2. 空白校正

• 使用與樣品相同的溶劑（如超純水、TE緩沖液、PBS等）。

• 在檢測(cè)孔中滴加1.5 μL溶劑，點(diǎn)擊“Blank”，完成基線(xiàn)扣除。

3. 樣品加載

• 將待測(cè)樣品1.5 μL加載至檢測(cè)孔。

• 儀器自動(dòng)檢測(cè)光強(qiáng)并調(diào)節(jié)光程。

• 測(cè)定完成后，擦拭檢測(cè)窗口，避免交叉污染。

4. 數(shù)據(jù)讀取

• 軟件界面直接顯示吸光度值、濃度值和純度比值。

• 支持結(jié)果導(dǎo)出為Excel或LIMS數(shù)據(jù)庫(kù)。

四、不同分子類(lèi)型的濃度測(cè)定

1. 核酸樣品

核酸在260 nm處具有最大吸收峰，其濃度可直接通過(guò)A260值計(jì)算：

• dsDNA（雙鏈DNA）：1 A260 = 50 ng/μL

• ssDNA（單鏈DNA）：1 A260 = 33 ng/μL

• RNA：1 A260 = 40 ng/μL

• 寡核苷酸：需根據(jù)序列計(jì)算摩爾消光系數(shù)

純度判定：

• A260/A280 比值：1.8~2.0為純凈核酸，低于此值提示蛋白污染

• A260/A230 比值：>2.0為理想值，偏低提示有機(jī)溶劑或鹽類(lèi)殘留

2. 蛋白樣品

蛋白質(zhì)在280 nm有特征吸收峰，主要來(lái)源于芳香族氨基酸（Trp、Tyr、Phe）。

• 直接法：A280檢測(cè)，需輸入摩爾消光系數(shù)或假設(shè)1 A280 = 1 mg/mL（適用于部分蛋白）。

• 染料法：Bradford法（595 nm）、BCA法（562 nm），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度。

純度判定：

• 蛋白樣品常結(jié)合光譜掃描確認(rèn)是否存在核酸或其他色素干擾。

3. 其他樣品類(lèi)型

• 多肽與合成分子：需根據(jù)序列或化學(xué)結(jié)構(gòu)計(jì)算理論消光系數(shù)。

• 色素與小分子：通過(guò)光譜掃描確定最大吸收峰，再建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行濃度換算。

五、實(shí)驗(yàn)案例解析

案例1：基因組DNA提取檢測(cè)

• 測(cè)量波長(zhǎng)：260 nm

• 結(jié)果：A260=0.25 → DNA濃度 = 12.5 ng/μL

• 純度比值：A260/A280=1.85，A260/A230=2.05 → 表明DNA較為純凈，可用于PCR擴(kuò)增。

案例2：RNA檢測(cè)

• 測(cè)量波長(zhǎng)：260 nm

• 結(jié)果：A260=0.4 → RNA濃度 = 16 ng/μL

• 純度比值：A260/A280=1.95，A260/A230=1.5 → 存在鹽類(lèi)或酚殘留，需進(jìn)一步純化。

案例3：重組蛋白濃度測(cè)定

• 測(cè)量波長(zhǎng)：280 nm

• 結(jié)果：A280=0.7，輸入摩爾消光系數(shù)后計(jì)算濃度 = 0.9 mg/mL

• 光譜掃描無(wú)核酸污染峰，結(jié)果可靠。

六、結(jié)果解讀與數(shù)據(jù)處理

1. 濃度結(jié)果：NanoDrop軟件直接給出數(shù)值，用戶(hù)可導(dǎo)出用于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2. 純度比值：是判定實(shí)驗(yàn)材料是否可用于下游實(shí)驗(yàn)的重要指標(biāo)。

3. 光譜曲線(xiàn)：通過(guò)掃描可發(fā)現(xiàn)異常吸收峰，幫助判斷雜質(zhì)來(lái)源。

4. 批量數(shù)據(jù)分析：NanoDrop Eight可同時(shí)檢測(cè)8個(gè)樣品，軟件支持?jǐn)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與對(duì)比。

七、常見(jiàn)問(wèn)題與優(yōu)化策略

1. 濃度結(jié)果偏低

• 原因：樣品降解、光程不穩(wěn)定、上樣不足

• 優(yōu)化：檢查樣品完整性，確保上樣體積準(zhǔn)確，使用校正后的移液器

2. A260/A280比值過(guò)低

• 原因：蛋白殘留

• 優(yōu)化：再次純化樣品，如使用柱式純化或酚氯仿抽提

3. A260/A230比值過(guò)低

• 原因：鹽類(lèi)或有機(jī)物殘留

• 優(yōu)化：乙醇沉淀或二次洗滌

4. 不同通道結(jié)果差異大

• 原因：檢測(cè)窗口未清潔，交叉污染

• 優(yōu)化：每次測(cè)量后及時(shí)用無(wú)絨紙巾擦拭窗口

5. 高濃度樣品超出檢測(cè)范圍

• 原因：光程過(guò)短仍超范圍

• 優(yōu)化：稀釋樣品，重新檢測(cè)

八、總結(jié)

賽默飛NanoDrop Eight分光光度計(jì)憑借微量上樣、多通道并行和自動(dòng)光程調(diào)節(jié)技術(shù)，極大地提升了核酸、蛋白及多種生物分子的濃度檢測(cè)效率。其結(jié)果解讀不僅依賴(lài)于吸光度轉(zhuǎn)化的濃度值，還需要結(jié)合純度比值和光譜掃描綜合判斷。

正確的樣品處理、合理的空白校正和規(guī)范的操作步驟，能夠確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。對(duì)于分子生物學(xué)研究而言，NanoDrop Eight提供的濃度與純度數(shù)據(jù)是后續(xù)PCR擴(kuò)增、測(cè)序、蛋白質(zhì)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行的前提保障。

通過(guò)科學(xué)使用NanoDrop Eight，研究人員能夠在最小樣品消耗的前提下，快速獲得可靠的定量信息，從而大幅度提升實(shí)驗(yàn)室工作效率與研究質(zhì)量。