伯樂 Gene Pulser Xcell 電穿孔儀樣本準(zhǔn)備

質(zhì)保3年只換不修，廠家長沙實了個驗儀器制造有限公司。

一、前言

伯樂（Bio-Rad）Gene Pulser Xcell 電穿孔儀是一款用于基因?qū)?、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及細(xì)胞轉(zhuǎn)染的高性能設(shè)備。其工作原理是通過短暫高壓脈沖作用，使細(xì)胞膜瞬時形成可逆性微孔，使外源DNA、RNA或蛋白質(zhì)等大分子進入細(xì)胞內(nèi)部。要想獲得理想的轉(zhuǎn)化效率，樣本準(zhǔn)備 是整個實驗流程中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。

樣本準(zhǔn)備不僅包括細(xì)胞的預(yù)處理與感受態(tài)制備，還涉及質(zhì)?；蚝怂針悠返募兓⒕彌_體系的優(yōu)化、樣品溫度控制及雜質(zhì)去除等多個方面。任何微小的偏差都可能導(dǎo)致電弧放電、細(xì)胞死亡或轉(zhuǎn)化效率下降。因此，系統(tǒng)、標(biāo)準(zhǔn)化的樣本準(zhǔn)備是保障電穿孔實驗成功率的前提。

二、樣本準(zhǔn)備的重要性

電穿孔是一種精細(xì)的物理導(dǎo)入方法，實驗中所有參數(shù)均依賴于樣本狀態(tài)。若細(xì)胞濃度、溶液電導(dǎo)率或DNA純度不符合要求，將直接影響膜電勢變化與孔洞形成。良好的樣本準(zhǔn)備能夠：

1. 提高細(xì)胞存活率：避免因離子濃度過高造成的過度放電或熱損傷；

2. 提高轉(zhuǎn)化效率：確保DNA能順利進入細(xì)胞并在復(fù)蘇期完成整合；

3. 減少實驗誤差：提高不同實驗間的重復(fù)性和可比性；

4. 延長儀器壽命：防止電弧放電造成電極損傷。

三、樣本準(zhǔn)備的總體要求

在 Gene Pulser Xcell 系統(tǒng)中，樣本準(zhǔn)備需遵循以下總體要求：

1. 低電導(dǎo)率：樣品溶液必須去離子化，避免鹽分殘留；

2. 低溫操作：操作應(yīng)在冰上完成，保持4℃環(huán)境以減少細(xì)胞應(yīng)激；

3. 無氣泡與雜質(zhì)：氣泡會導(dǎo)致電場集中，引起電??；

4. 均勻混合：DNA或RNA與感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)充分混勻但避免劇烈震蕩；

5. 快速處理：混合樣品應(yīng)立即進行電擊，防止膜電位變化失衡。

四、樣本類型分類與特點

1. 細(xì)菌樣本

以大腸桿菌（E. coli）為代表的原核細(xì)胞體積小、膜厚、對電擊耐受性高。
特點：

• 易制備高活性感受態(tài)；

• 轉(zhuǎn)化效率受鹽濃度與電場強度影響明顯；

• 使用 0.1 cm 或 0.2 cm 電穿孔杯效果較好。

2. 酵母及真菌樣本

細(xì)胞壁較厚，導(dǎo)入效率低于細(xì)菌，但可通過酶解預(yù)處理改善。
特點：

• 需去除細(xì)胞壁或使用酶解法形成原生質(zhì)體；

• 含高滲保護劑（如山梨醇、甘露醇）以維持形態(tài)；

• 電壓與電容需高于細(xì)菌體系。

3. 哺乳動物細(xì)胞

膜結(jié)構(gòu)脆弱，對電擊極為敏感。
特點：

• 需在等滲緩沖液中處理；

• 方波模式優(yōu)于指數(shù)衰減波；

• 電擊后迅速復(fù)蘇以提高存活率。

4. 植物原生質(zhì)體

去壁細(xì)胞，體積大，需中強度電場。
特點：

• 操作環(huán)境需高滲；

• 細(xì)胞數(shù)量控制精確；

• 電擊后需補充Ca2?促進膜修復(fù)。

五、感受態(tài)細(xì)胞制備

1. 細(xì)菌感受態(tài)

以大腸桿菌為例：

步驟

1. 取單克隆菌落接種入5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜；

2. 次日1:100比例接種入新鮮LB培養(yǎng)基；

3. 培養(yǎng)至OD600≈0.5（對數(shù)生長期）；

4. 置冰上冷卻10 min以抑制代謝；

5. 4℃、4000 rpm離心10 min，棄上清；

6. 用預(yù)冷無菌10%甘油溶液洗滌三次；

7. 最終重懸于少量10%甘油中（約2×10? cells/mL）；

8. 分裝至無菌離心管，置冰上待用或-80℃保存。

注意事項

• 培養(yǎng)基必須不含鹽（NaCl等）殘留；

• 洗滌液使用無離子甘油可顯著降低電導(dǎo)；

• 細(xì)胞狀態(tài)對電轉(zhuǎn)化效率影響顯著，過老或過嫩均不宜使用。

2. 酵母感受態(tài)

步驟

1. 培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集細(xì)胞；

2. 用1.2 M山梨醇緩沖液洗滌2次；

3. 以溶壁酶或Zymolyase處理30 min制備原生質(zhì)體；

4. 再次離心洗滌并重懸于高滲緩沖液中；

5. 置冰上備用。

要點

• 原生質(zhì)體制備需在無菌條件下完成；

• 電穿孔時液體體積控制在40–60 μL；

• 電擊后立即加入山梨醇復(fù)蘇液防止破裂。

3. 動物細(xì)胞樣本

準(zhǔn)備步驟

1. 將細(xì)胞培養(yǎng)至70–80%融合度；

2. 使用胰酶輕柔消化，離心收集；

3. 用無Ca2?、無Mg2? PBS洗滌2次；

4. 重懸于等滲電穿孔緩沖液（如Cytoporation Buffer）中；

5. 計數(shù)調(diào)整至1×10? cells/mL；

6. 放置冰上備用。

注意事項

• 避免細(xì)胞聚集或氣泡；

• 所有緩沖液需過濾除菌；

• 不可使用含血清或鹽分高的培養(yǎng)液。

六、核酸樣品準(zhǔn)備

1. 質(zhì)粒DNA

電穿孔對DNA純度要求極高。
要求與處理：

• 純度A260/A280應(yīng)在1.8–2.0；

• 徹底脫鹽，避免任何Tris、NaCl、EDTA殘留；

• 溶解介質(zhì)推薦無離子水或低離子緩沖液（如TE 1:100稀釋）；

• 儲存于-20℃，使用前置冰解凍。

濃度建議

• 對細(xì)菌：10–100 ng/μL；

• 對動物細(xì)胞：1–5 μg/mL；

• 過高濃度會導(dǎo)致電導(dǎo)率上升，增加電弧風(fēng)險。

2. RNA與蛋白樣品

RNA或蛋白轉(zhuǎn)染樣品應(yīng)保持結(jié)構(gòu)完整。

• RNA樣品需避免RNase污染；

• 蛋白樣品應(yīng)保持緩沖液電導(dǎo)率低且pH 7.0–7.4；

• 可在電擊前加入穩(wěn)定劑如甘油或蔗糖以保護樣品。

七、混合與上樣

1. 混合比例

一般情況下，DNA與感受態(tài)細(xì)胞體積比例為1:20至1:40。
例如：

• 40 μL細(xì)胞 + 1–2 μL DNA。

2. 操作步驟

1. 將感受態(tài)細(xì)胞加入至預(yù)冷電穿孔杯；

2. 加入DNA樣品輕輕混勻；

3. 確保液面平整無氣泡；

4. 放置冰上待電擊，不超過2分鐘。

3. 關(guān)鍵要點

• 所有操作均應(yīng)在冰上完成；

• 混合后應(yīng)立即進行電擊；

• 若出現(xiàn)氣泡，應(yīng)棄樣重新配制。

八、樣品溫度與離子控制

電穿孔過程中能量釋放迅速，會導(dǎo)致局部加熱。若樣本溫度過高，細(xì)胞會迅速死亡。
溫度控制措施：

• 電擊前樣品保持在0–4℃；

• 電擊后立即加入預(yù)溫復(fù)蘇液（37℃），避免溫差沖擊；

• 每次電擊間隔至少5分鐘，使電極降溫。

離子濃度控制：

• 使用去離子水或低離子甘油溶液制備細(xì)胞懸液；

• 避免NaCl、KCl、Tris等強電解質(zhì)；

• 若必須加入離子組分，應(yīng)控制在1–5 mM以下。

九、電穿孔后的樣品處理

1. 立即復(fù)蘇
   電擊結(jié)束后，在杯中迅速加入1 mL預(yù)溫SOC或特定復(fù)蘇液；

2. 輕柔混勻
   避免劇烈搖動，防止受損細(xì)胞破裂；

3. 復(fù)蘇培養(yǎng)

• 對細(xì)菌：37℃搖床復(fù)蘇1小時；

• 對動物細(xì)胞：37℃、5% CO?培養(yǎng)2–4小時后更換新培養(yǎng)基；

4. 檢測與保存

• 電轉(zhuǎn)后取部分樣品接種平板驗證陽性克??；

• 余下樣品可冷凍保存以供分析。

十、常見問題與解決方案

十一、實驗記錄與質(zhì)量控制

在樣本準(zhǔn)備過程中，應(yīng)建立詳細(xì)記錄表，包括：

• 樣品編號與制備時間；

• 感受態(tài)細(xì)胞OD值與保存條件；

• DNA濃度與純度；

• 電擊參數(shù)及時間常數(shù)；

• 電擊前后樣品體積與溫度。

記錄數(shù)據(jù)用于質(zhì)量追蹤與后期實驗優(yōu)化。

十二、樣本準(zhǔn)備的自動化與優(yōu)化方向

隨著實驗室自動化的發(fā)展，部分樣本制備流程已可通過機器人系統(tǒng)實現(xiàn)。
未來優(yōu)化方向包括：

1. 自動溫控與攪拌系統(tǒng)：確?；旌暇鶆蚯覝囟群愣ǎ?/p>

2. 微流控上樣系統(tǒng)：精確控制電場作用體積；

3. 低離子仿生緩沖液：在保持生理穩(wěn)定的同時減少電導(dǎo)率；

4. 預(yù)警檢測機制：實時監(jiān)控導(dǎo)電率與溫度，防止電弧。

十三、廠家服務(wù)與技術(shù)支持

長沙實了個驗儀器制造有限公司 為伯樂 Gene Pulser Xcell 系列設(shè)備的授權(quán)技術(shù)服務(wù)單位，提供：

• 原廠耗材供應(yīng)與電穿孔杯更換；

• 樣品制備指導(dǎo)與標(biāo)準(zhǔn)操作培訓(xùn)；

• 定期校正與性能檢測；

• 三年質(zhì)保，只換不修，確保實驗安全高效；

• 提供定制化參數(shù)優(yōu)化方案。

該服務(wù)體系確?？蒲腥藛T在樣本準(zhǔn)備與儀器使用全過程中獲得專業(yè)技術(shù)保障。

十四、總結(jié)

樣本準(zhǔn)備是電穿孔實驗的核心環(huán)節(jié)。無論是細(xì)胞活性、DNA純度、緩沖液組成，還是溫度與離子濃度的控制，均直接影響導(dǎo)入效果。

通過科學(xué)、系統(tǒng)的準(zhǔn)備流程，可顯著提升實驗穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)化效率。Gene Pulser Xcell 電穿孔儀憑借精準(zhǔn)的脈沖控制與可靠的硬件系統(tǒng)，為各種細(xì)胞類型的基因?qū)胩峁├硐肫脚_。在廠家長沙實了個驗儀器制造有限公司的技術(shù)支持與質(zhì)保體系下，研究人員能夠安全、穩(wěn)定地開展長期實驗工作，確保數(shù)據(jù)真實可靠。