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伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2660是一款廣泛應用于分子生物學、基因工程及細胞轉(zhuǎn)染實驗的高性能設備。其核心原理是利用瞬時高壓脈沖在細胞膜上形成可逆性孔道，使外源DNA、RNA或蛋白質(zhì)進入細胞內(nèi)部，實現(xiàn)基因?qū)牖蚍肿愚D(zhuǎn)化。
設備以高穩(wěn)定性、高重復性和多功能控制著稱，適用于細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物原生質(zhì)體及其他真核體系。為了確保實驗的成功率與數(shù)據(jù)的可重復性，嚴格遵循標準化的操作流程尤為重要。本文將系統(tǒng)介紹165-2660電穿孔儀的實驗步驟，從設備準備到實驗后處理，全面闡述每個環(huán)節(jié)的關鍵細節(jié)與操作要點。
在每次實驗前，應對電穿孔儀進行全面檢查，確保設備處于最佳工作狀態(tài)：
檢查電源是否穩(wěn)定（建議220V ±10%）；
確認儀器顯示屏正常、按鍵靈敏；
確保電極槽清潔無鹽分或殘留液體；
檢查電轉(zhuǎn)杯與接觸點是否完好無裂痕；
打開電源后，觀察自檢提示是否正常顯示“Ready”。
若發(fā)現(xiàn)任何異常（如“Check Cuvette”“Arc Detected”等提示），應暫停實驗并重新確認連接狀態(tài)。
實驗應在潔凈、干燥、無電磁干擾的環(huán)境下進行；
操作者需佩戴防護手套與護目鏡；
禁止在設備帶電狀態(tài)下更換電轉(zhuǎn)杯；
儀器使用后應自動放電30秒后再進行維護。
電穿孔的核心是細胞樣品的質(zhì)量。不同細胞類型對電壓與環(huán)境條件的要求不同。通用準備原則如下：
細菌樣品：培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600≈0.6），用10%甘油洗滌3次，保持低導電性。
酵母樣品：提前進行酶解或滲透緩沖液預處理，去除細胞壁部分成分。
哺乳細胞：保持高活性、無鈣鎂離子環(huán)境，懸浮于等滲無鹽緩沖液。
植物原生質(zhì)體：確保酶解完全，懸浮于含0.5 M甘露醇緩沖液中以維持滲透壓。
樣品溫度應保持在4°C左右，避免過熱導致膜損傷。
核酸純度：A260/A280比值1.8–2.0；
濃度：10–100 ng/μL；
溶劑：無鹽Tris或超純水；
無任何乙醇、鹽或酚殘留。
根據(jù)細胞類型選擇合適電壓范圍：
| 樣品類型 | 推薦電壓范圍 | 電轉(zhuǎn)杯間隙 | 電場強度(kV/cm) |
|---|---|---|---|
| 大腸桿菌 | 2.3–2.5 kV | 0.2 cm | 11–12.5 |
| 酵母 | 1.0–1.5 kV | 0.2 cm | 5–7.5 |
| 哺乳動物細胞 | 0.25–0.8 kV | 0.4 cm | 0.6–2 |
| 植物原生質(zhì)體 | 0.6–1.0 kV | 0.4 cm | 1.5–2.5 |
在設備前面板上旋轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)旋鈕或通過數(shù)字輸入鍵設定所需值。
165-2660配備多檔電容系統(tǒng)（25 μF–3300 μF），實驗者可依據(jù)所需能量選擇合適電容。電容越高，脈沖持續(xù)時間越長。
時間常數(shù)τ = R × C，一般理想值如下：
細菌：4–5 ms；
酵母：6–8 ms；
哺乳細胞：8–10 ms；
植物原生質(zhì)體：10–12 ms。
設定完成后，按下“Ready”鍵確認系統(tǒng)進入待機狀態(tài)。
165-2660可輸出單脈沖或多脈沖信號。
單脈沖：用于細菌與酵母；
多脈沖：用于真核細胞轉(zhuǎn)染。
間隔可設定為50–500 ms，建議默認100 ms以防熱積累。
取50–100 μL細胞懸液于無菌離心管中，加入1–5 μL高純DNA溶液。輕輕吹打混勻，不可劇烈震蕩。
混合液保持在冰上備用，以減少電轉(zhuǎn)前溫升。
選擇合適間隙的電轉(zhuǎn)杯（0.1、0.2或0.4 cm），確保干燥潔凈。
若杯體剛清洗完，應完全晾干；
用移液器吸取混合樣品注入電轉(zhuǎn)杯中，液體應覆蓋電極并無氣泡；
若出現(xiàn)氣泡，可輕敲杯壁排除。
將電轉(zhuǎn)杯放入儀器電極槽內(nèi)，確保接觸緊密。
合上安全蓋后，顯示屏應自動提示“Ready”。此時系統(tǒng)進入待命狀態(tài)。
按下“Pulse”或“Start”鍵，儀器輸出瞬時高壓脈沖。整個放電過程僅持續(xù)數(shù)毫秒。
結(jié)束后屏幕會顯示：
實際電壓（kV）；
放電時間常數(shù)（ms）；
脈沖曲線狀態(tài)。
若出現(xiàn)“ARC DETECTED”提示，說明發(fā)生電弧，應檢查緩沖液鹽分或樣品氣泡。
放電完成后，立即用無菌移液器吸出樣品，轉(zhuǎn)入預先準備的復蘇培養(yǎng)基中。
復蘇條件：
細菌：37°C搖床復蘇45–60分鐘；
酵母：30°C靜置復蘇1小時；
哺乳細胞：37°C培養(yǎng)2–4小時后更換新鮮培養(yǎng)基；
植物原生質(zhì)體：在等滲液中靜置12小時以上恢復。
復蘇后的細胞根據(jù)實驗目的進行培養(yǎng)或篩選：
對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的樣品，可在含抗生素平板上涂布；
對轉(zhuǎn)染細胞，可進行熒光檢測或抗性篩選；
對植物樣品，可觀察再生能力及轉(zhuǎn)化率。
記錄實驗參數(shù)：電壓、電容、脈沖次數(shù)、時間常數(shù)、樣品體積、溫度等。
165-2660可自動保存最近1000次放電數(shù)據(jù)，便于結(jié)果追蹤與參數(shù)優(yōu)化。
實驗結(jié)束后，斷開電源并等待自動放電結(jié)束。
使用無離子水沖洗電轉(zhuǎn)杯與電極槽，必要時可用70%乙醇消毒。
徹底晾干后保存，防止殘留離子腐蝕。
電壓過低會導致穿孔不足，轉(zhuǎn)化率低；電壓過高則細胞死亡率高。應在初次實驗時使用較低電壓起始，逐步增加以確定最佳條件。
一般電壓與電容匹配規(guī)則：
細菌：2.5 kV / 25 μF；
酵母：1.5 kV / 50 μF；
哺乳細胞：0.45 kV / 250 μF；
植物原生質(zhì)體：0.8 kV / 1000 μF。
任何氣泡都會形成局部高電阻，導致電弧放電。
操作時應緩慢注液；
電轉(zhuǎn)杯應預冷；
樣品導電性控制在理想范圍（4–6 μS/cm）。
高溫會加速細胞膜破裂。所有樣品及杯體應預冷至4°C，放電后立即進行復蘇。
復蘇時間不足會導致細胞膜修復不完全。對于不同體系應根據(jù)膜修復特性合理延長。
| 問題 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 出現(xiàn)電弧放電 | 緩沖液導電性高或樣品中有氣泡 | 重新洗滌樣品，排氣泡，更換緩沖液 |
| 時間常數(shù)異常低 | 樣品電阻過小或電容設置錯誤 | 檢查緩沖液成分，調(diào)整電容 |
| 轉(zhuǎn)化效率低 | 電壓過低、DNA濃度不足 | 提高電壓或DNA濃度 |
| 樣品過熱 | 連續(xù)放電間隔過短 | 延長間隔或降低電容 |
| 無放電反應 | 電轉(zhuǎn)杯未接觸良好 | 重新插入電轉(zhuǎn)杯或清潔電極 |
理想時間常數(shù)表明放電均勻。若τ過低，說明電流過快，能量未充分作用；若τ過高，則樣品電阻過大，需更換緩沖液或降低細胞密度。
轉(zhuǎn)化效率 = 陽性克隆數(shù) / 投入DNA量（μg）。
通過對比不同電壓與電容組合下的效率，可獲得最優(yōu)電穿孔參數(shù)。
通過復蘇后細胞計數(shù)或顯微鏡觀察判斷。若死亡率高于50%，需降低能量參數(shù)或縮短脈沖。
放電后等待30秒再取出電轉(zhuǎn)杯，防止殘余電荷；
禁止在安全蓋打開時啟動放電；
定期檢查電極接觸點有無腐蝕或變形；
每3–6個月進行電壓輸出校準；
存放設備時應斷電并覆蓋防塵罩。
電轉(zhuǎn)杯：0.2 cm
電壓：2.5 kV
電容：25 μF
樣品體積：80 μL
放電時間常數(shù)：4.9 ms
結(jié)果：轉(zhuǎn)化效率1×10? CFU/μg DNA。
電轉(zhuǎn)杯：0.4 cm
電壓：0.45 kV
電容：250 μF
脈沖數(shù)：2次，間隔100 ms
放電時間常數(shù)：8.5 ms
結(jié)果：蛋白表達效率80%，細胞活性保持70%。
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