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伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2661是一款專業(yè)的高壓脈沖電轉(zhuǎn)化儀，專為基因?qū)?、?xì)胞電轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)而設(shè)計(jì)。該設(shè)備通過瞬時高壓脈沖在細(xì)胞膜上形成可逆性孔洞，使外源DNA、RNA或其他帶電分子穿過細(xì)胞膜，從而實(shí)現(xiàn)高效導(dǎo)入。
165-2661作為伯樂電穿孔儀系列的改進(jìn)型號，在電壓精度、能量釋放速度、放電穩(wěn)定性以及電弧防護(hù)系統(tǒng)方面均有顯著提升。其操作系統(tǒng)采用數(shù)字化控制面板，可自動計(jì)算時間常數(shù)（τ），并具備多組參數(shù)存儲功能，便于用戶快速調(diào)用常用實(shí)驗(yàn)設(shè)置。
本文將對165-2661的操作步驟、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、放電執(zhí)行流程、安全管理及數(shù)據(jù)記錄方法進(jìn)行系統(tǒng)闡述，以指導(dǎo)科研人員在操作中實(shí)現(xiàn)高重復(fù)性、高效率與安全性的統(tǒng)一。
實(shí)驗(yàn)室溫度：20–25°C；
相對濕度：≤60%；
電源規(guī)格：AC 220 V ±10%，50/60 Hz；
接地電阻：≤1 Ω；
環(huán)境條件：無強(qiáng)磁場干擾、無高濕、無導(dǎo)電塵埃；
通風(fēng)要求：儀器背部至少保持30 cm的散熱間距。
在開機(jī)前必須完成以下自檢：
檢查電源線是否完好并確認(rèn)接地端連接正確；
檢查電極接口、輸出端無污漬與腐蝕；
確認(rèn)安全蓋感應(yīng)系統(tǒng)靈敏；
清潔電轉(zhuǎn)杯與支架，避免殘留鹽分或水分；
檢查主機(jī)顯示屏能正常亮起，鍵盤操作響應(yīng)靈敏。
如設(shè)備自檢失敗或出現(xiàn)“Check System”提示，應(yīng)停止使用并聯(lián)系維護(hù)人員。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)對象不同，細(xì)胞制備方式略有差異。以下以常見的大腸桿菌和哺乳細(xì)胞為例：
細(xì)菌（如E. coli DH5α）
取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220 rpm培養(yǎng)過夜；
將1 mL菌液接種入100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD???≈0.4；
離心收集菌體（4000 rpm，4°C，5分鐘）；
使用冰冷10%甘油溶液洗滌3次，去除培養(yǎng)基鹽分；
重懸于10%甘油溶液中，濃度約1×10? cells/mL；
4°C保存，24小時內(nèi)使用。
哺乳動物細(xì)胞（如CHO或HeLa）
使用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收集并離心；
重懸于無血清緩沖液或電穿孔專用緩沖液中；
調(diào)整濃度至2×10? cells/mL；
保持低溫備用（4°C）。
將外源DNA或RNA溶液（通常為1–2 μg）加入感受態(tài)細(xì)胞中；
混合均勻后置于冰上預(yù)冷3–5分鐘；
檢查液體是否無氣泡，避免放電時產(chǎn)生電弧。
選擇合適間隙的電轉(zhuǎn)杯（0.1、0.2或0.4 cm）；
使用無菌純水清洗并風(fēng)干；
放入冰上預(yù)冷10分鐘后使用。
165-2661的數(shù)字化面板可實(shí)現(xiàn)高精度參數(shù)設(shè)定。以下為詳細(xì)設(shè)置流程：
電壓設(shè)定（Voltage）
按下“VOLTAGE”鍵進(jìn)入電壓設(shè)定界面；
使用方向鍵輸入所需電壓（范圍0.2–2.5 kV）；
按“ENTER”確認(rèn)。
電容設(shè)定（Capacitance）
按“CAP”鍵選擇電容檔位；
可調(diào)范圍：25、50、125、250、500、1000、3300 μF；
系統(tǒng)自動切換儲能單元并顯示實(shí)際值。
電阻選擇（Resistance）
默認(rèn)固定電阻200 Ω；
特殊實(shí)驗(yàn)可啟用外接電阻模塊（選配）。
模式選擇（Mode）
單脈沖模式：適合細(xì)菌、酵母等；
多脈沖模式：適合哺乳動物細(xì)胞；
程序模式：保存常用參數(shù)，快速調(diào)用。
安全檢測確認(rèn)
設(shè)備自動檢測電極接觸、電源接地及安全蓋狀態(tài)；
顯示“Ready to Pulse”后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
吸取40–50 μL細(xì)胞混合液加入電轉(zhuǎn)杯；
確保液面均勻覆蓋電極表面；
輕拍電轉(zhuǎn)杯底部，排出微小氣泡；
插入電擊槽，確保電極完全接觸。
關(guān)閉安全蓋；
按下“PULSE”鍵；
系統(tǒng)瞬時釋放儲能電量并開始放電；
顯示屏實(shí)時顯示放電電壓、時間常數(shù)（τ）及狀態(tài)信息；
放電完成后屏幕顯示“Pulse Complete”。
正常放電：顯示“OK”，時間常數(shù)為穩(wěn)定衰減曲線（如4.8 ms）；
電弧放電：顯示“ARC DETECTED”，表示樣品導(dǎo)電性過高或存在氣泡；
放電中斷：顯示“ABORTED”，通常由安全蓋打開或接地異常引起。
如檢測到異常，應(yīng)立即停止操作，重新制備樣品或檢查電轉(zhuǎn)杯。
樣品冷卻
放電后立即取出電轉(zhuǎn)杯并置于冰上1–2分鐘，防止熱效應(yīng)損傷細(xì)胞。
復(fù)蘇與培養(yǎng)
向電轉(zhuǎn)杯中加入1 mL冰冷SOC或無血清培養(yǎng)基；
輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至離心管；
在37°C下復(fù)蘇60分鐘（細(xì)菌）或在37°C、5% CO?條件下復(fù)蘇4小時（哺乳細(xì)胞）。
篩選培養(yǎng)
涂布含抗生素的平板（對細(xì)菌）；
接種入選擇性培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)染培養(yǎng)體系（對真核細(xì)胞）；
培養(yǎng)12–24小時后觀察結(jié)果。
伯樂165-2661具備數(shù)據(jù)存儲與導(dǎo)出功能。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)記錄以下信息：
| 項(xiàng)目 | 參數(shù)值 | 備注 |
|---|---|---|
| 電壓 | 2.5 kV | 設(shè)定值 |
| 電容 | 25 μF | 檔位2 |
| 電極間隙 | 0.2 cm | 標(biāo)準(zhǔn)杯 |
| 時間常數(shù) | 4.8 ms | 實(shí)測值 |
| 電弧狀態(tài) | 無 | 正常放電 |
| 樣品溫度 | 4°C | 冰浴條件 |
| 轉(zhuǎn)化效率 | 9.8×10? CFU/μg DNA | 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可通過USB接口導(dǎo)出至電腦進(jìn)行存檔與分析。
高壓防護(hù)
嚴(yán)禁在安全蓋打開時放電；
操作時手部不得接觸電極區(qū)域；
每次放電后等待5秒再取樣，防止殘余電荷。
樣品安全
使用低導(dǎo)電緩沖液，避免電弧損壞；
禁止含鹽PBS或NaCl溶液進(jìn)入電轉(zhuǎn)杯；
每次實(shí)驗(yàn)后清洗電極，防止鹽沉積。
環(huán)境防護(hù)
保持實(shí)驗(yàn)臺干燥，防止漏電；
遠(yuǎn)離磁性設(shè)備與熱源；
放電時避免他人靠近。
異常處理
若設(shè)備報(bào)警或屏幕閃爍異常，應(yīng)立即斷電；
檢查高壓電纜連接與接地狀態(tài)，確認(rèn)無異常后再重新啟動。
為確保重復(fù)性與安全性，建議建立以下標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）：
開機(jī)前檢查表
電源與接地是否正常；
電極與電轉(zhuǎn)杯是否干凈；
溫度與濕度是否達(dá)標(biāo)。
參數(shù)記錄模板
每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)完整記錄電壓、電容、時間常數(shù)、溫度及電弧狀態(tài)。
重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
同一條件下連續(xù)放電10次，若時間常數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差<0.2 ms，則系統(tǒng)穩(wěn)定。
月度維護(hù)
清潔電極接口；
檢查風(fēng)扇與散熱系統(tǒng)；
驗(yàn)證電壓輸出精度（偏差≤1%）。
| 問題 | 原因分析 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 電弧頻繁 | 樣品電導(dǎo)率過高或有氣泡 | 使用低離子緩沖液并排氣泡 |
| 時間常數(shù)偏低 | 電阻下降或電極污染 | 清潔電極并更換緩沖液 |
| 放電不啟動 | 安全蓋未關(guān)閉或接地異常 | 檢查安全鎖和電源線 |
| 樣品加熱嚴(yán)重 | 能量過大或復(fù)蘇延遲 | 降低電壓并立即冰浴 |
| 無菌落生長 | DNA質(zhì)量低或細(xì)胞損傷 | 優(yōu)化DNA純度并調(diào)整能量 |
優(yōu)化電壓與電容比例
電壓決定電場強(qiáng)度，電容影響能量持續(xù)時間。
細(xì)菌推薦2.5 kV/25 μF；哺乳細(xì)胞推薦0.4–0.8 kV/250 μF。
控制時間常數(shù)
理想時間常數(shù)應(yīng)保持在4–10 ms之間。
過短導(dǎo)致導(dǎo)入不完全，過長增加熱損傷。
緩沖液優(yōu)化
使用電導(dǎo)率≤10 μS/cm的低離子緩沖體系；
推薦使用10%甘油、HEPES或Tris衍生緩沖液。
樣品體積與間隙匹配
確保液體完全覆蓋電極表面；
間隙過大或體積不足均會影響電場均勻性。
以大腸桿菌DH5α為模型的電穿孔實(shí)例：
電壓：2.5 kV
電容：25 μF
電轉(zhuǎn)杯間隙：0.2 cm
樣品體積：50 μL
時間常數(shù)：4.8 ms
結(jié)果：獲得穩(wěn)定菌落，轉(zhuǎn)化效率9.6×10? CFU/μg DNA。
此條件下能量釋放平穩(wěn)，細(xì)胞活性高，證明儀器性能可靠。
杭州實(shí)了個驗(yàn)生物科技有限公司
